Восстановление биосинтеза монотерпеновых индольных алкалоидов в геномно-инженерном проекте Nicotiana benthamiana

Биология связи, том 5, Номер статьи: 949 (2022) Цитировать эту статью

3902 Доступа

10 цитат

26 Альтметрика

Подробности о метриках

Монотерпеновые индольные алкалоиды (МИА) представляют собой разнообразный класс растительных натуральных продуктов, которые включают ряд важных с медицинской точки зрения соединений. Мы намеревались восстановить путь образования стриктозидина, ключевого промежуточного соединения всех МИА, из центрального метаболизма у Nicotiana benthamiana. Недостаток этого хозяина состоит в том, что его богатый фоновый метаболизм приводит к дериватизации некоторых гетерологично продуцируемых молекул. Здесь мы используем транскриптомный анализ для идентификации гликозилтрансфераз, активация которых активируется в ответ на промежуточные продукты биосинтеза, и создаем линии растений с целевыми мутациями в кодирующих их генах. Экспрессия раннего пути MIA в этих линиях обеспечивает более благоприятный профиль продукта. Биосинтез стриктозидина был успешно восстановлен, причем наилучшие результаты были получены при совместной экспрессии 14 ферментов, из которых главный латексный протеиноподобный фермент (MLPL) из Nepeta (кошачья мята) имеет решающее значение для улучшения потока через иридоидный путь. Удаление эндогенных гликозилтрансфераз не влияет на выход стриктозидина, подчеркивая, что метаболический поток ферментов пути к стабильному промежуточному биосинтезу сводит к минимуму необходимость в конструировании эндогенного метаболизма хозяина. Производство стриктозидина in planta расширяет спектр продуктов МИА, поддающихся биологическому синтезу.

Применение подходов синтетической биологии к инженерным системам растений способствовало прогрессу в контроле и реализации путей биосинтеза, позволяя растениям служить альтернативным биохимическим производственным шасси1,2. Родственник табака, N. benthamiana3,4, стал предпочтительным видом для растительного производства фармацевтических белков5 и восстановления метаболического пути2. Успехи включают производство тритерпеноидов в граммах6 и производство этопозидов7 в миллиграммах. Однако в нескольких исследованиях сообщалось о накоплении непреднамеренных побочных продуктов, предположительно вызванных нецелевой активностью эндогенных ферментов N. benthamiana, таких как оксидазы и гликозилтрансферазы8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. , 18. Хотя в некоторых исследованиях активность эндогенных ферментов использовалась для получения новых молекул9 или для компенсации отсутствия известного фермента19, дериватизация молекул по большей части является недостатком, поскольку снижает потенциальную чистоту и выход целевого соединения.

Монотерпеновые индольные алкалоиды (МИА) представляют собой большую группу натуральных продуктов растительного происхождения, из которых идентифицировано более 300020. Этот класс молекул включает множество ценных с медицинской точки зрения соединений, используемых для лечения наркомании, сердечных заболеваний, деменции, боли, рака, малярии и диабета. Наиболее изученным растением-продуцентом МИА является катарантус розовый (барвинок мадагаскарский), который производит более 130 МИА, включая биоактивные винбластин и винкристин, которые используются в качестве химиотерапевтических средств. Однако эти ценные молекулы присутствуют в C. roseus в низких концентрациях (0,0005% сухого веса)21, что ограничивает их доступность. Массовое культивирование клеток C.roseus возможно, но о клеточной линии, которая стабильно продуцирует эти противораковые молекулы, пока не сообщалось22. Хотя сообщалось о методах временной экспрессии23 и стабильной генетической трансформации24 растений C.roseus, генная инженерия нативного растения-хозяина для увеличения выхода этих соединений остается технически сложной. Более того, структурная сложность многих МИА означает, что химический синтез часто является сложной задачей25,26. Следовательно, желательны альтернативные пути продукции, а недавнее открытие недостающих этапов пути винбластина27,28 делает реконструкцию пути у гетерологичного хозяина все более привлекательным вариантом.

Достижение производства терапевтически полезных количеств MIA требует разработки путей для максимизации метаболического потока на ранних этапах пути. Стриктозидин является последним распространенным промежуточным продуктом биосинтеза, из которого происходят все более 3000 известных MIA. Восстановление примерно 11-ступенчатого пути биосинтеза у микроорганизмов может потребовать обширной настройки условий экспрессии фермента и оптимизации штамма29, например, плохая экспрессия гераниол-8-гидроксилазы (G8H) препятствует выработке стриктозидина в дрожжах30. Получение полезных выходов таких молекул, как винбластин, которые потребовали бы экспрессии еще 16+ ферментов, помимо стриктозидина, вероятно, потребует серьезных инженерных разработок, хотя недавно были созданы дрожжи для производства аймалицина посредством геномной интеграции 29 экспрессирующих кассет, что демонстрирует потенциал для гетерологичной реконструкции путей биосинтеза растительных натуральных продуктов31.

95. Scale bar represents the number of substitutions per site. A tree with all taxa and bootstrap values is provided in Supplementary Fig. 1./p>60 fold while supplementation of GPPS improved yield ~5 fold. DXS supplementation did not change the amount of strictosidine produced (Fig. 1)./p>60 fold while supplementation of GPPS improves yield ~5 fold. c the total ion chromatogram of leaf tissue infiltrated with the entire pathway to strictosidine (including DXS, GPPS, and MLPL). The peak at 4.09 min retention time in the total ion chromatogram (TIC) and extracted ion chromatogram (EIC) at 531.2336 m/z matches a strictosidine standard. N.D., not detected; 7-DLH, 7-deoxyloganic acid hydroxylase; LAMT, loganic acid O-methyltransferase; SLS, secologanin synthase; TDC, tryptophan decarboxylase; STR, strictosidine synthase. Values and error bars represent the mean and the standard error of n = 3 or n = 6 biological replicates (independent leaf samples)./p> 0.993). Putative identification of metabolites was based on the acquisition of high-resolution mass spectrometry data to determine the best fit elemental composition using the Data Analysis software (Bruker)./p>327 amino acids and including an intact Plant Secondary Product Glycosyltransferase (PSPG) box. Protein sequences of 107 UGTs from Arabidopsis thaliana were obtained from the A. thaliana cytochrome P450, cytochrome b5, P450 reductase, b-glucosidase, and glycosyltransferase site (http://www.p450.kvl.dk) as in described33. An additional 9 UGT sequences previously reported to have activity on geraniol or other iridoid substrates from Actinidia deliciosa (kiwifruit)77, Camellia sinensis (tea)78, C. roseus79, Gardenia jasminoides (Cape jasmine)80, Sorghum bicolor81, Vitis vinifera (grape)82,83 were also included. Sequences and accession numbers are listed in Supplementary Table 8. The 193 sequences were aligned using MUSCLE 3.8.425 (Edgar 2004) and a phylogenetic tree with 100 bootstraps was generated using RAxML version 8.2.1184 within the Geneious program. Phylogenetic trees were visualized using Interactive Tree Of Life (iTOL)85./p>