Предполагаемая цитотоксическая сериновая протеаза Salmonella typhimurium UcB5, обнаруженная в недоваренном гамбургере.

Научные отчеты, том 13, Номер статьи: 3926 (2023) Цитировать эту статью

350 доступов

Подробности о метриках

Предполагаемая экзопротеаза вирулентности, обозначенная как UcB5, была успешно очищена из бактерии Salmonella typhimurium до электрофоретической гомогенности с 13,2-кратным и 17,1% выходом с помощью гидрофобной, ионообменной и гель-проникающей хроматографии с использованием фенил-сефарозы 6FF, DEAE-сефарозы CL-6B. и Сефадекс G-75 соответственно. С помощью электрофореза в ДСН-ПААГ молекулярную массу подтвердили на уровне 35 кДа. Оптимальные температура, pH и изоэлектрическая точка составляли 35 °С, 8,0, 5,6 ± 0,2 соответственно. Было обнаружено, что UcB5 обладает широкой субстратной специфичностью почти ко всем протестированным хромогенным субстратам с максимальным сродством к N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA, достигая Km 0,16 мМ, Kcat/Km 3,01 × 105 S-1 M. -1, а амидолитическая активность - 28,9 мкмоль мин-1 л-1. Он резко ингибировался TLCK, PMSF, SBTI и апротинином, в то время как DTT, β-меркаптоэтанол, 2,2'-бипиридин, о-фенантролин, ЭДТА и ЭГТА не оказали никакого эффекта, что свидетельствует о типе сериновой протеазы. Кроме того, он продемонстрировал широкую субстратную специфичность в отношении широкого спектра природных белков, включая сывороточные белки. Исследование цитотоксичности и электронная микроскопия показали, что UcB5 может вызывать субклеточный протеолиз, который в конечном итоге приводит к некрозу печени. Для этого будущие исследования должны быть сосредоточены на использовании комбинации внешних антипротеаз и противомикробных агентов для лечения микробных заболеваний, а не на использовании только лекарств.

Токсины и ферменты действуют как ключевые агенты вирулентности в микробном патогенезе внутри больных хозяев1,2. Бактериальные токсины полностью охарактеризованы и их роль в патогенезе хорошо изучена, тогда как роль микробных протеаз в патогенезе животных и растений изучена недостаточно. Это может быть результатом сложности ферментов и отсутствия избирательности по сравнению с токсинами3. Протеазы давно идентифицированы в клеточных экстрактах многих патогенных бактерий4. Возможно, вы удивитесь, узнав, что большинство из них долгое время были неопознанными и были полностью определены лишь недавно. Микробы продуцируют множество типов протеаз, которые подразделяются на сериновые, металло-, аспарагиновые и цистеиновые. Некоторые из них специфически ингибируются ингибиторами протеаз плазмы, известными как серпины, тогда как большинство из них устойчивы или инактивируют антипротеазы плазмы человека. В результате, попав внутрь, они ускорят лечение болезни и ухудшение состояния хозяина5.

Их участие в вирулентности было связано с различными методами. Чтобы начать процесс инвазии или переварить белки хозяина для доступа к пептидным питательным веществам, они сначала протеолизируют и разрушают ткани хозяина. Например, вмешиваясь в клеточные сигнальные белки или протеолизуя белки компонентов матрикса, протеаза HtrA в первую очередь способствует распространению заболеваний. Во-вторых, они могут активировать субъединичные токсины (АТ-токсины) путем отделения активной части (субъединицы А) от связывающей части (субъединицы В). В-третьих, некоторые из них, такие как протеазы Clp и Lon, действуют внутри цитозоля непосредственно путем своевременного разрушения контроллеров вирулентности и опосредованно, обеспечивая устойчивость к внутренним антагонистическим компонентам, таким как супероксиды и свободные радикалы, чтобы остановить эффекторные компоненты иммунной системы хозяина против инфицирования. бактериальный возбудитель6.

S. enterica с более чем 2000 сероваров может вызывать множество различных заболеваний. Серовар Enteritidis и Typhimurium являются наиболее распространенной причиной гастроэнтерита у людей, тогда как другие серовары, такие как S. typhi, являются основной причиной смертельных системных заболеваний. Интересно, что мутанты серовара Typhimurium, у которых отсутствуют протеазы clpP или clpX, оказались невирулентными штаммами, что указывает на значимость протеазы ClpXP при сальмонеллезе7. Кроме того, мутанты серовара, лишенные Lon-протеазы, очень чувствительны к H2O2 и кислотности, поэтому неспособны персистировать внутри макрофагов и пролиферировать в дистальных частях тела, вызывая заболевания8. Установлено, что пептидаза N серовара Typhimurium является первичной аминопептидазой внутри цитозолей с широким диапазоном субстратной активности9.